(1)将长成单层的细胞从CO₂培养箱中取出，在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是 否需要传代及细胞需要稀释的倍数。在超净工作台中倒去培养瓶中旧的培养液，然后加入适 量的Hanks液，轻轻摇动片刻，将溶液倒出，以除去残留的血清和衰老脱落的细胞。

(2)向培养瓶中加入适量的消化液(0.25%胰蛋白酶溶液+0.02% EDTA溶液),以盖满细胞 面为宜，置于室温或温箱中2~3分钟。同时在倒置显微镜下观察，到细胞回缩近球形，细胞间隙 增大时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，将胰酶倒掉，注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

(3)加入少量含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁，形成分散的细胞悬 液为止。

(4)取一滴细胞悬液进行计数，依据细胞浓度将其分装到两瓶或多瓶中，每个瓶中分别加 3~5ml培养液，盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO₂气体的进入。做好标记，注明细胞代 号、操作日期(图13-3)。

(5)对悬浮培养的细胞，可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

将分装好的培养瓶置于CO₂培养箱中，传代细胞须逐日观察，注意细胞有无污染，培养液颜 (色的变化以及细胞生长情况。一般情况下，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶的壁 上，2~4天就可以在瓶内形成单层，并需要再次传代。

可根据细胞占瓶壁的有效面积的百分率分为四级：+:细胞占瓶壁有效面积的25%以内， 有新生细胞；++:细胞占瓶壁有效面积的25%~75%;+++:细胞占瓶壁有效面积的75%~95%; ++++:细胞占瓶壁有效面积的95%以上，细胞已铺满，单层，致密，透明度好。