原理
细胞增殖的检测对于评估细胞健康，确定遗传毒性或评估抗癌药物至关重要。目前直接测量DNA合成是最准确的方法，在复制过程中将核苷类似物（例如[3H]胸苷或5-溴-2'-脱氧尿苷）加入到细胞中，然后通过放射自显影或使用BrdU抗体来进行检测。EdU法细胞增殖成像分析试剂盒（绿色荧光）是一种替代BrdU的新型检测方法。EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）是胸腺嘧啶核苷的核苷类似物，可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。与BrdU方法相比EdU-Click检测不是基于抗体，因此不需要通过DNA变性（变性通常使用氯化氢、加热或脱氧核糖核酸酶消化）来检测加入的核苷。检测基于Click反应，叠氮化物和炔烃之间由铜催化的共价反应，整个反应30 min内可完成。
自备耗材
·低温离心机
·可调节式移液枪及枪头
·去离子水
·固定液（含3.7%甲醛的PBS）
·通透剂（含0.5%Triton X-100的PBS）
试剂制备
EdU (10 mM)：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
BSA Wash Solution(1×)：向BSAWash Solution（5×）中添加磷酸盐缓冲液（PBS），将5×母液稀释成1×工作液（终浓度为3% BSA），并混匀。使用后分装并保存在-20℃，该溶液可稳定保存6个月。
AbFluor 488 Azide：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
Reaction Buffer(10×)：即用型，使用前，平衡到室温；4℃保存。
Copper Reagent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Reducing Agent(10×)的配制：向Reducing Agent中添加去离子水配制终浓度为100 mg/mL的Reducing Agent（10×）并混合直至化合物完全溶解。使用后分装-20℃保存，该溶液可稳定保存6个月。若溶液变成棕色，说明组分已经降解，不建议继续使用。
Hoechst33342(1×)：临用前配制，用PBS按1：1,000的比例配成1×Hoechst33342工作液；分装，-20℃避光保存。
Hydroxyurea：DNA合成抑制剂；即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
实验步骤
A. EdU标记培养细胞
本实验以96孔板培养的贴壁细胞为例。悬浮细胞可在孵育EdU后进行涂片处理（将适量细胞滴加到载玻片上，酒精灯烘烤至干燥），涂片后从固定开始与贴壁细胞采用相同的染色步骤。
1. 孔板内放入适配盖玻片，接种适量细胞，使其生长至所需密度后处理细胞；
2. 可选步骤：阴性对照的设置：EdU孵育前加入DNA合成抑制剂Hydroxyurea，按1:1,000的比例直接加入到阴性对照孔内，混匀孵育0.5 h；
3. 用10 mM EdU溶液在培养基中制备2×EdU工作溶液（20 µM）。推荐的EdU终浓度为10 µM，用细胞培养液1:500稀释10 mM EdU即可得到2×EdU工作溶液（20 µM）；
4. 将预热（37℃）的2×EdU溶液等体积添加到含有试验细胞的培养基中，使96孔板中的EdU终浓度变为1×；
注意：建议不要更换所有培养基，因为这会影响细胞增殖速率；建议EdU起始浓度是10 µM。
5. 在最适合的条件下孵育细胞2h（根据细胞扩增时间确定，一般肿瘤细胞的孵育时间为2 h）；
6. 孵育后除去培养基，并向每个孔中加入0.1 mL固定液（含3.7%甲醛的PBS），室温下孵育15 min；
7. 除去固定液，用0.1 mL BSAWash Solution(1×)浸洗孔中细胞5 min，重复3次；
8. 除去洗涤液，向每个孔中加入0.1 mL通透剂（含0.5%Triton X-100的PBS），室温下孵育15min；
9. 除去通透剂，用0.1 mL BSA Wash Solution (1×)浸洗孔中细胞5 min，重复2次；
10. 转步骤C。
B. EdU标记活体动物
本实验以6周龄小鼠为例，其它动物体内EdU的标记请参考相关文献。
1. 对于小鼠，可以按照10-200 mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定浓度，加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用50 mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。EdU需单独购买；
2. 可选步骤：阴性对照的设置：EdU处理时加入DNA合成抑制剂Hydroxyurea，按1000 mg/kg的浓度用EdU溶液进行配制。Hydroxyurea需单独购买；
3. 24小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整；
4. 对于冰冻切片：
(1) 加入适量固定液（含3.7%甲醛的PBS），室温下孵育15 min；
(2) 除去固定液，用适量BSAWash Solution(1×)浸洗5 min，重复3次；
(3) 除去洗涤液，加入适量通透剂（含0.5%Triton X-100的PBS），室温孵育15min；
(4) 除去通透剂，用适量BSAWash Solution(1×)浸洗5 min，重复2次；
(5) 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理；
(6) 转步骤C。
5. 对于石蜡切片：
(1) 脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10 min，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10 min。组织复性：在无水乙醇中洗涤5 min，换新的无水乙醇洗涤3 min；然后依次在95%、85%、75%和50%乙醇中洗涤3 min；最后在PBS中洗涤5 min。
(2) 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理；
注意：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
(3) 转步骤C。
C.EdU 检测
注意：在该步骤中，每孔使用100 µL反应混合物。对于其它孔板或切片，反应混合物体积可根据实际情况进行调节，但必须按比例加入反应组分。
1. 根据下表制备Click-iT反应混合物；
注意：要按表中列出的顺序添加成分，否则反应将无法得到最佳效果。配置好的Click-iT反应混合物必须在15 min内使用。
组分体积
Deionized Water758 µL
Reaction Buffer（10×）100 µL
Copper Reagent40 µL
AbFluor 488 Azide2 µL
Reducing Agent（10×）100 µL
Total Volume1 mL
2. 向每个样品中加入100 µLClick-iT反应混合物，室温下避光孵育30 min；
3. 除去反应混合物，用0.1 mL BSA Wash Solution (1×)浸洗孔中细胞5 min，除去洗涤液；
4. 可选步骤：进行核染色（1×Hoechst33342）或抗体标记；
重要提示：在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色，孵育后请直接进行成像和分析。
5. 用荧光显微镜（Ex/Em = 501/525 nm）分析样品中标记的DNA，用Ex/Em = 360/460 nm检测细胞核。
注意事项
1. 为避免交叉污染，在加入不同样本和不同试剂时都需更换吸头。
2. 实验开始前确保所有的组分及设备处于合适的温度。
3. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
FAQ
[if !supportLists]1. [endif]该试剂盒是否可以染间充质干细胞，再进行活体移植？
A: 建议先在体外培养观察染色效果，再进行移植实验，并在一周内进行显色和观察。
[if !supportLists]2. [endif]该试剂盒可以做组织染色吗？
A: EdU适用于细胞增殖的检测，如客户想进行组织染色，建议用增殖抗体PCNA（货号ABP0112、A01040、ABP59848）及其直标抗体进行IHC实验检测。
[if !supportLists]3. [endif]该试剂盒是否可以用免疫荧光（IF）一起双染？先后顺序是怎样的？
A: 可以和IF进行双染，建议先进行EdU染色标记，再进行IF染色。